ПЦР: метод, который слишком хорош

• Лабораторные методы обнаружения инфекций
• Этапы диагностики методом ПЦР
• Что может ПЦР
• Чего не может ПЦР
• Выводы

Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR), изобретенная американским ученым Кэрри Муллисом в 1983 году, и метод обнаружения ДНК, основанный на этой технологии, принесли ему Нобелевскую премию по химии в 1993 году. Сегодня ПЦР является одним из наиболее точных методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Он позволяет обнаружить то, что раньше оставалось незамеченным.

Почему же этот удивительный метод не полностью вытеснил другие методы лабораторной диагностики, а используется наряду с ними, иногда уступая им в некоторых аспектах?

Лабораторные техники обнаружения инфекций

Выявление инфекций в биологических жидкостях пациентов может быть осуществлено различными способами.

• Определение под микроскопом.

Лабораторный сотрудник, используя оптический инструмент, ищет патогенные микроорганизмы в образце жидкости, окрашенном специальным способом, взятом из мочеполового тракта или слизистой оболочки. Этот метод недорогой, простой, но не очень информативный. В результате можно выявить триходоны, гонококки, хламидии, уреаплазму и гарднереллу. И все.

• Культурные методы (выращивание микроорганизмов в искусственных условиях).

После того как такой же мазок нанесли на питательную среду в чашке Петри, ждут, что вырастет. В результате микроорганизмы формируют различные колонии — разного цвета, формы, размера и текстуры. Именно по этим колониям можно определить, кто находился в мазке. Этот процесс, хоть и не дорогой, но долгий: выращивание микроорганизмов может занять от 3 до 8 недель, в течение которых состояние пациента может ухудшиться. Есть нюанс: вырастет только то, что было в мазке и только в определенном количестве. Если патогенных бактерий было слишком мало, то их невозможно будет обнаружить.

• Проведение анализов крови.

После контакта с организмом любые возбудители оставляют свои иммунные следы в крови человека — антигены или антитела. Хотя метод быстрый, он не самый дешевый. Важно помнить, что инфекция может уже находиться в организме до того, как антитела и антигены станут обнаружимы. Это может быть связано со слишком коротким временем прошедшим с момента заражения или недостаточной концентрацией патогенных микроорганизмов. Более того, данный метод не способен различать различные виды микроорганизмов, не все из которых являются опасными для человека.

В общем, все методы имеют свои недостатки. Основные из них включают следующее:

• Имеет место невысокая чувствительность, что означает, что в пробе должно присутствовать определённое минимальное количество микроорганизмов для их обнаружения.
• Присутствует невысокая специфичность, то есть если у двух различных видов бактерий (один из которых опасен, а другой нет) имеются одинаковые белки на поверхности их клеток, то не все тесты могут точно определить, какой вид именно содержится в организме.

Обе эти проблемы решаются с использованием метода ПЦР.

Этапы диагностики методом ПЦР

Основная идея метода заключается в том, что каждый живой организм (микро- или макро-) обладает своей уникальной ДНК (либо РНК, если речь идет о некоторых вирусах). Это идеальный индикатор наличия чужеродного микроорганизма в организме человека. Даже если в анализе обнаруживаются следы ДНК, это означает, что организм уже встречался с данной инфекцией. Но как можно обнаружить эти слабые следы? Их необходимо сначала увеличить.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) включает в себя несколько этапов.

• 1 этап. Подготовка образца, то есть извлечение ДНК.

Допустим, что мы ищем в образце определенную бактерию, например, хламидию (Chlamydia trachomatis – возбудитель хламидиоза). На данном этапе мы не уверены, содержит ли образец ее ДНК. Образец обрабатывается специальным образом, чтобы сконцентрировать ДНК в минимальном объеме жидкости для проведения ПЦР.

• Этап 2: Увеличение (размножение) ДНК с использованием ПЦР.

Вначале двухцепочечную ДНК разделяют, повышая температуру, и получают одноцепочечные нити. Затем в раствор добавляют специальные короткие фрагменты нуклеиновой кислоты — праймеры. Они будут использоваться для синтеза второй цепи ДНК на одноцепочечных основаниях. Итак, основание есть, праймер есть, остается добавить нуклеотиды, из которых будет строиться вторая цепь, и фермент, который выполнит эту работу. Фермент ДНК-полимераза выступает в качестве этого инструмента, а процесс сборки одноцепочечной ДНК в двухцепочечную называется полимеразной цепной реакцией.

В начале процесса у нас было две мононитевые молекулы ДНК, а в конце мы получим два двухнитевых ДНК. И такой процесс повторяется многократно, пока число ДНК не станет достаточным для дальнейшего анализа в лаборатории. Для увеличения количества ДНК используют специальные устройства — амплификаторы. На данном этапе исследователи также пока не знают, какая именно ДНК была усилена, и содержит ли образец ДНК хламидии.

Также важно отметить, что существует множество различных методов ПЦР, которые выбираются в зависимости от поставленной задачи перед исследователем.

• Этап 3. Обнаружение ДНК.

В настоящий момент происходит проверка наличия ДНК искомого бактериального организма в образце. Ранее для этой цели применялся метод электрофореза, однако впоследствии исследователи стали использовать ДНК-зонды – особые отмеченные участки ДНК, которые взаимодействуют только с конкретным участком исследуемой ДНК, позволяя тем самым определить определенные последовательности нуклеотидов. В настоящее время для экспресс-диагностики используются флуоресцентные маркеры, которые позволяют определить результат полимеразной цепной реакции прямо в пробирке. Если ДНК хламидии обнаружена в образце, лаборанту это станет известно.

Что делать в случае, если вирусный геном представляет собой РНК, а не ДНК? Примером может служить пандемический коронавирус SARS-CoV-2. В таких ситуациях необходим еще один шаг — обратная транскрипция. Из образца слизи, взятого из носоглотки, извлекают РНК, проводят процедуру обратной транскрипции и получают аналог в виде ДНК. Затем эту ДНК усиливают и обнаруживают. Поэтому для выявления коронавируса используется метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).

Что может ПЦР

Использование метода ПЦР позволяет обнаруживать вредоносные микроорганизмы и определять их устойчивость к медикаментам. В сравнении с традиционными методами, ПЦР работает намного быстрее и точнее. Этот метод все чаще применяется в медицине. Например, с помощью него можно определить генетические маркеры устойчивости к лекарствам.

Преимущества метода ПЦР:

• Высокая чувствительность.

Для выявления вредоносных микроорганизмов в организме пациента достаточно даже одной копии их ДНК. В случае с ПЦР уже 1 микроорганизм в образце достаточно, чего нельзя сказать о других методах диагностики.

• Специфичность.

Как было отмечено ранее, уникальность генетического материала каждого вида микроорганизмов позволяет выявить их даже при наличии больших объемов посторонней, лишней, мешающей проведению анализа «балластной» ДНК.

• Скорость выполнения анализа.

Весь процесс диагностики методом ПЦР занимает не более одного рабочего дня.

• Производительность.

ПЦР-диагностика на сегодняшний день представляет собой полностью автоматизированный процесс.

Чего не может сделать ПЦР

Метод ПЦР – это действительно великое изобретение молекулярной биологии XX века. Однако иногда он настолько хорош, что не пригоден для диагностики.

Недостатки ПЦР:

• Специфичность.

Она невероятно высокая, однако слишком узкая. Если вы сеете что-то в чашке Петри, то всё, что было в пробирке, вырастет. Но при проведении ПЦР вы найдете только то, что искали, то, для чего использовали ДНК-зонды. Нельзя случайно обнаружить гепатит, проводя анализ на хламидии.

• Чувствительность.

Существует огромное количество микроорганизмов, которых врачи относят к условно-патогенным. Они составляют часть нормальной микрофлоры человека, пока их количество не превысит определенных пределов. ПЦР, конечно, обнаружит их присутствие, но это не означает, что человек болен. Среди таких микроорганизмов можно назвать микоплазму, уреаплазму, гарднереллу и другие.

• Проблема контаминации.

Контаминация – это засорение образца ДНК из вне. Диагностика при помощи ПЦР должна проводиться в специально подготовленных лабораториях и в стерильных условиях. Даже один образец «внешней» ДНК из другого источника, из воздуха лаборатории или с рук лаборанта может вызвать ложноположительные результаты – при наличии нужных праймеров.

• Воздействие других компонентов образца на ПЦР.

Чувствительность ПЦР может снижаться под влиянием различных веществ. Например, некоторые препараты (антикоагулянты) могут подавить реакцию усиления. Существуют специальные методы контроля для выявления подобных ситуаций. Но риск получения ложноотрицательных результатов все еще остается.

• Цена и стоимость процедуры.

Использование данного метода является непосильным для многих клиник и лабораторий из-за высокой стоимости самого оборудования, необходимых реактивов и требующихся специалистов. На территории России подобные устройства не изготавливаются, а применение отечественных реактивов снижает точность проводимого анализа.

Выводы

• Метод ПЦР, хоть и считается одним из лучших среди современных способов определения возбудителей различных инфекционных заболеваний, не всегда оправдан из-за своей высокой стоимости.
• Доверьтесь мнению врача, если он считает, что анализ ПЦР не требуется. Не стоит самостоятельно делать такие выводы, так как самолечение и сдача анализов в сетевых лабораториях могут привести к лечению неприсущей вам болезни в течение многих лет.
• Если вам не нравится результат анализа, предоставленный лабораторией, пересдайте его в другом месте. Риск ошибок в результатах всегда присутствует, исследования методом ПЦР не исключение.

Преимущества и недостатки метода ПЦР

Применение Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) в медицине и науке

Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) является одним из самых важных методов в современной медицине и науке. Ее применение позволяет проводить анализы биологического материала с высокой точностью и скоростью, что делает этот метод неотъемлемым инструментом для исследований в различных областях.

Одним из главных преимуществ метода ПЦР является его высокая чувствительность, благодаря которой даже самые малые количества ДНК или РНК могут быть обнаружены. Это делает ПЦР незаменимым инструментом для диагностики различных заболеваний, включая инфекционные и онкологические.

Среди других преимуществ ПЦР можно выделить скорость выполнения анализов, возможность автоматизации процесса, а также масштабируемость – это позволяет проводить одновременно анализы большого количества образцов в короткие сроки.

Однако, существуют и недостатки данного метода.

Один из основных недостатков ПЦР – возможность возникновения ложноположительных результатов из-за загрязнения образцов или неправильной обработки данных. Это требует особой осторожности и контроля со стороны специалистов, чтобы обеспечить достоверность результатов.

Кроме того, стоимость оборудования для проведения ПЦР-анализов может быть довольно высокой, что делает этот метод недоступным для небольших лабораторий с ограниченным бюджетом.

Применение ПЦР в медицине и науке

В современном медицинском и научном мире метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) играет ключевую роль в проведении исследований и диагностике различных болезней. Этот метод позволяет увеличивать количество ДНК или РНК в образце, что делает его незаменимым в различных областях науки и медицины.

Применение ПЦР в медицине	Применение ПЦР в науке
Диагностика инфекционных заболеваний	Идентификация генетических мутаций
Скрининг на наследственные заболевания	Исследование популяционной генетики
Мониторинг эффективности лечения	Археологические и палеонтологические исследования

В медицине ПЦР применяется для диагностики инфекционных заболеваний, скрининга на наследственные патологии, мониторинга эффективности терапии. В науке же данный метод используется для идентификации генетических мутаций, изучения популяционной генетики, а также для проведения археологических и палеонтологических исследований.

Современные тенденции в развитии метода ПЦР

Современная эпоха науки и технологий продолжает диктовать новые направления развития метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод постоянно совершенствуется и находит все более широкое применение в различных областях жизни.

Одним из основных направлений развития ПЦР является увеличение скорости и точности реакции. Современные исследователи стремятся к созданию более быстрых и эффективных методов ПЦР, которые позволят проводить исследования в более короткие сроки и с большей точностью.

Важным аспектом современных тенденций в развитии ПЦР является автоматизация процесса. Специалисты работают над созданием автоматических систем, которые позволят проводить ПЦР без участия человека, что значительно упростит и ускорит процесс проведения исследований.

Кроме того, современные технологии позволяют применять ПЦР для анализа меньших объемов образцов, что является важным достижением в развитии метода. Это открывает новые возможности для исследований и обеспечивает более эффективное использование материала.

Непрерывное совершенствование метода ПЦР открывает перед нами новые перспективы и возможности. С появлением новых технологий и методов, ПЦР продолжает оставаться одним из самых важных инструментов современной науки и медицины.

Роль ПЦР в борьбе с инфекционными заболеваниями

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) играет значительную роль в обнаружении инфекционных заболеваний и эпидемиологических исследованиях. Он позволяет быстро и точно выявлять патогены, что имеет важное значение для контроля передачи заболеваний и управления эпидемическими ситуациями.

• ❖ Быстрое обнаружение заболеваний: благодаря ПЦР-анализам специалисты могут быстро идентифицировать возбудителей инфекционных заболеваний, что позволяет начать лечение пациента в самые короткие сроки.
• ❖ Точность диагностики: методика ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет исключить ложно-положительные результаты и дает возможность точно определить наличие определенного патогена.
• ❖ Мониторинг эпидемической ситуации: с помощью ПЦР можно проводить мониторинг распространения инфекционных заболеваний, что помогает разрабатывать эффективные меры по их контролю и предотвращению.

В современном мире метод ПЦР стал неотъемлемой частью работы медицинских учреждений и лабораторий, способствуя более успешной борьбе с инфекционными заболеваниями и защите общественного здоровья.

Видео по теме:

Вопрос-ответ:

Что такое Полимеразная цепная реакция (ПЦР)?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод воспроизведения определенного участка ДНК в больших количествах. Он позволяет создать много копий конкретного участка ДНК, что облегчает его анализ.

Какие основные преимущества метода детекции ДНК на основе ПЦР?

Основные преимущества метода детекции ДНК на основе ПЦР включают высокую чувствительность, специфичность и скорость анализа. Этот метод позволяет быстро и точно определить наличие или отсутствие определенной последовательности ДНК.

Какую роль сыграла ПЦР в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний?

ПЦР стала одним из самых точных методов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний благодаря своей способности обнаруживать скрытые инфекции, которые ранее были трудно диагностировать. Этот метод позволяет выявить возбудителей заболеваний даже в самых незначительных количествах.

Какую награду получил Кэрри Муллис за открытие ПЦР?

За открытие Полимеразной цепной реакции (ПЦР) американский ученый Кэрри Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году. Его открытие изменило подход к молекулярной биологии и стало одним из важнейших методов в современной науке.

Как работает метод детекции ДНК на основе ПЦР?

Метод детекции ДНК на основе ПЦР работает путем усиления определенного участка ДНК за счет циклического нагревания и охлаждения. Этот процесс позволяет создать множество копий целевой ДНК, которые потом могут быть обнаружены и проанализированы.

Что такое Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и каков ее принцип работы?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод в биохимии, который позволяет увеличить количество ДНК в образце за счет ее многократного копирования. Принцип работы ПЦР заключается в циклическом повторении трех шагов: денатурации ДНК (разделение двух цепей), отжиге праймеров (коротких одноцепочечных нуклеотидов) и синтезе новой ДНК с использованием специального фермента — ДНК-полимеразы. В результате каждый цикл удваивает количество исходной ДНК, что позволяет быстро и эффективно увеличить количество материала для анализа.